Terapia genica per il morbo di Canavan

“Traduzione dall’inglese della Prof.ssa Emanuela Medoro
non revisionata dall’autrice.”

Trasferimento globale del gene
nel sistema nervoso centrale nell’infanzia per la deficienza dell’enzima
neurogenetico: morbo di Canavan

Paola Leone, Christopher G Janson, Scott J McPhee & Matthew J During

Indirizzo (al momento dell’articolo)

CNS Gene Therapy Center
Department of Neurosurgery
Thomas Jefferson University
Philadelphia
PA 19107
USA

Il prototipo di malattia neurogenetica scelta per verificare la nostra strategia di terapia genica è la malattia di Canavan (CD).
CD è una leucodistrofia autosomica recessiva associata ad una degenerazionespongiforme del cervello. Al momento la malattia è “uniformemente”fatale nei casi studiati. La CD è caratterizzata da una mutazione nel gene aspartocilase (ASPA), che comporta una perdita dell’attività dell’enzima.

In questo articolo, è riassunta prova recente nell’etiologia e possibili trattamenti per la CD. In particolare, noi discuteremo due sistemi di “rilascio genico” rappresentativi dei recenti progressi fatti sia nella tecnologia liposomica che virale : un nuovo complesso cationico liposome-polymer-DNA, protamina (LPD) DCChol/DOPE,ed anche un vettore-virus ricombinante adeno-associato (AAV).

INTRODUZIONE E precedenti

Nell’era attuale della medicina molecolare, i medici sono costretti a pensare alle malattie in termini delle loro basi genetiche.
Infatti ci si aspetta che quelle patologie possano in definitiva essere spiegate come un insieme di “difetti” genetici biochimici (influenzati geneticamente). CD, o deficienza di N-acetil aspartic
aciclase, è una leucodistrofia infantile fatale che è caratterizzata dalla mancanza di idrolisi di N-acetil aspartato(NAA), che comporta un accumulo locale di NAA nel cervello così come una NAA acidemia e aciduria. Myrtelle Canavan nel 1931 presentò per la prima volta un caso di questa malattia come una variante dell’encephalie periaxiale diffusa’ di Schilder, con degenerazione della guaina del midollo spinale con risparmio di assoni. I vari casi descritti da Schilder si rivelarono o sclerosi multiple, o adrenoleucodistrofie o panencefaliti sclerosanti subacute [1],invece che CD e furono solo le indagini successive a illustrare il profilo distintivo e le caratteristiche morfologiche e biochimiche di CD. Con migliori conoscenze molecolari
del processo della malattia e con l’avvento di terapie sperimentali più efficaci, il vecchio problema dell’identificazione e delle diagnosi “approssimative” è ben superato.

Il malato di Canavan esaminato in origine presentava vomito, costipazione, e mancanza di aumento di peso; il bambino mancava le tappe fondamentali dello sviluppo come afferrare gli oggetti oppure tenere su la testa; il cranio cresceva progressivamente e si allargava sproporzionatamente; si notava inoltre nistagmo verticale e strabismo convergente; l’ipotonia iniziale fu seguita più tardi da sintomi di iperreflessia.

Quando il bambino morì all’età di 16 mesi, l’autopsia dimostrò perdita di mielina subcorticale e un diffuso e marcato edema della materia bianca [2]. La patologia spongiforme del cervello distintiva della CD, che sembra assomigliare ad una “spugna intrisa d’acqua” [3], è stata poi chiarita in letteratura da Van Bogaert e Bertrand [4]. Il difetto biochimico comune a tutti i malati di CD, tuttavia, non fu scoperto prima del 1988, quando Matalon e collaboratori scoprono l’enzima mutante aspartocilase (ASPA) [5·]. Sebbene il gene ASPA fosse clonato nel 1993 e la mutazione più comune sia stata isolata [6], la patologia cellulare che risulta nella CD non è ancora stata chiarita e il contributo del sottostrato molecolare (NAA) è ancora poco chiaro.

Sintomi e Patologia

Molti sintomi di CD sono comuni ad altri disordini di acidi organici e includono megaloencefalia, atassia, sintomi miocloni ed extrapiramidali (ipotonia, distonia e discinesia) [7].

La tipica progressione dei sintomi extrapiramidali è ipotonia seguita da un graduale aumento di tono, risultanti infine in rigidità, spasticità e choreoatheosis. In più, spesso c’è un considerevole ritardo psicomotorio e mentale, manifestato da apatia e mancato raggiungimento delle tappe fondamentali dello sviluppo.
Sono comuni anche assalti parziali o del gran male, e dagli studi di Traeger e Rapin, risulta che il 63% dei pazienti con CD ha una qualche forma di epilessia [8]. Alcune caratteristiche
della CD come la macroencefalia, il ritardo mentale, la spasticità e l’atrofia ottica si ritrovano anche in altre leucodistrofie, come la malattia di Tay Sach’s e di Alexander.

A prescindere dall’aumento di NAA, che è unico di CD, la caratteristica degenerazione a spugna nella CD è l’aspetto più insolito della patologia.
Un simile cambiamento morfologico può avvenire dopo l’esposizione a certe tossine (come, triethyl tin, cuprizone, iproniazide). Il primo studio ultrastrutturale fu pubblicato da Adachi nel 1966, e mostrava larghi spazi all’interno della guaina mielinica, come pure un rigonfiamento dei processi e cellule astrociti [9]. Altri hanno notato una mancanza di demarcazione della materia corticale bianca e grigia, con vacuoli multipli (fino a 200 mm di diametro) attraverso la corteccia profonda e la materia bianca subcorticale.

La patologia spugniforme è caratterizzata da accumulazione di fluido eccessivo principalmente entro la lamelle mieliniche e i processi astrocitici [10].In modo tipico si osservano mitocondri allungati negli astrociti. I nuclei ed i corpi cellulari dei neuroni sono di solito intatti senza mostrare anormalità [9].Qualche volta si vedono oligodendrociti vacuolati, ma la maggior parte degli oligodendrogli sono normali anche in aree di spazio extracellulare allargato e guaine mielinichein disintegrazione.Nella corteccia, in uno studio si trovò che la spugnosità corrispondeva agli astrociti rigonfi, mentre nella materia bianca i vacuoli erano formati dal fluido intramielinico ed extracellulare (ECF) [11].In generale è colpito l’intero sistema nervoso centrale (CNS) con vacuolizzazione della materia bianca più evidente nel cervelletto e nel brainstem.[12].

RELAZIONE DI NAA E ASPA ALLA PATOLOGIA DELLA MALATTIA .

Interessa notare che NAA è strettamente organizzato in compartimenti entro il cervello. NAA è sintetizzato solo nel CNS, e,in modo più specifico, solo entro i mitocondri dei neuroni [13.,14]Si trova in alte concentrazioni entro i neuroni ( da 5 a 10mM.) e da molto tempo è ritenuto un marcatore specifico- neurale. D’altra parte ASPA ha un’ampia distribuzione del tessuto ed è stato isolato dal rene umano, dal glande adrenale, polmone, fegato, e pelle(15). Entro il cervello, ASPA è localizzato principalmente nella materia bianca, dove si trova nella più alta concentrazione fra gli assoni e la mielina (16).E’ stato riferito che ASPA non si può scoprire nella materia grigia e nella componenti del sangue(17).Questo fatto è significativo, poiché si è suggerito che il trapianto del midollo osseo (BMT) possa essere un mezzo migliorativo per abbassare NAA nel morbo di Caravan. Un paziente recentemente ha ricevuto un trapianto di midollo osseo con la speranza di abbassare NAA sistemico (Krivit W ,comunicazione personale).Il trapianto di midollo osseo è stato usato in parecchie altre leucodistrofie CNS, ma la sua rilevanza nel CD è ignota.

Nel CD i livelli interstiziali sia di NAA che di NAAG (N-acetil-aspartil-glutamato, prodotto biosintetico di NAA).I neuroni hanno un notevole aumento del livello di NAA sulla materia bianca e tuttavia la materia grigia non presenta un significativo cambiamento patologico nella CD, il che nega un ruolo direttamente tossico di NAA nella patogenesi. Comunque, è stato ipotizzato che livelli alti di NAA possono essere tossici quando applicati alla cellule gliali, e tuttavia sono risparmiate le cellule neuronali. Gli studi su NAA e NAAG dimostrano un legamento limitato ai recettori NMDA e suggeriscono che sono possibili effetti tossici in vitro [19] ;livelli relativamente bassi(circa 1 mM)di NAA o di NAAG non sono neurotossici quando sono applicati a colture di cellule arricchite di neuroni [20],ma livelli più alti di NAA (da 3 a 10 mM circa) possono elevare il calcio intracellulare fino a tre volte.[21].
Si sa che alcune cellule gliali sono sensibili all’excitotossicità glutamata, ma il fatto che studi ultrastrutturali hanno dimostrato limitato coinvolgimento del corpo cellulare oligodendrocito nel CD contrasta una semplice ipotesi citotossica di NAA e NAAG per quella cellule.

Da qualche tempo si discute la normale funzione di NAA.E’stato suggerito che un ruolo fondamentale è quello di donatore di acetile nella lipogenesi. Il gruppo acetile di NAA è incorporato in vari lipidi del cervello e del fegato; è trasformato in acetato e acetil-CoA in ambedue i tessuti [22]. Pertanto si ipotizza che NAA funzioni come mezzo di deposito di acetato e per la produzione di acetil CoA. Per CD ciò implica che una diminuzione dell’acetil CoA disponibile (a causa dell’impossibilità di ASPA a dividere NAA) porterebbe alla mancanza di reazioni che richiedono acetil-CoA. Questo spiegherebbe la evidente demielinizzazione del CD, comunque non rende conto in modo specifico dei cambiamenti spongiformi.

Un’altra ipotesi sulla normale funzione di NAA è che esso funzioni come parte di una pompa (ad acqua) osmotica. Per mezzo di studi anatomici comparati di pesci,anfibi e mammiferi, Baslow concluse che NAA non idrolizzato in ECF funzioni come diuretico osmolare per tirar fuori l’acqua, che può congestionare gli assoni e rompere la guaina mielinica senza distruggere gli assoni [3]. Sebbene all’epoca il meccanismo fosse oscuro, l’idea che uno squilibrio di acqua causasse la demielinizzazione fu proposta fin dagli anni ’60.Van Bogart e Bertrand avanzarono l’ ipotesi secondo cui la ritenzione di liquido nel tessuto nervoso rompe la normale mielina , ed un edema nell’area di mielina intatta può distruggere quest’ultima.il gonfiore edematoso può precedere la demielinizzazione:si ritiene ,infatti, che la distruzione della mielina possa essere il risultato del gonfiore spugnoso”[3].In tempi più recenti, esperimenti di microdialisi in vvo sono stati portati avanti su topi,che sostengono un ruolo osmoregolatore per NAA, in cui l’esposizione(step) ai mezzi iposmotici aumenta livelli dialasati di NAA.[29.].

Baslow ha suggerito che NAA,NAAG, carnosina e omocarnosina ” probabilmente hanno una funzione comune come regolatori di flusso d’acqua cellulare.”[16].Quando questo flusso d’acqua è accentuato dalla non degradazione di NAA nella spazio extracellulare, può manifestarsi il gonfiore intramielinico tipico del CD. Baslow ha inoltre proposto un flusso transcellulare, causato dall’efflusso ed interruzione di NAA, con il mantenimento di un altro gradiente tessuto a EFC di NAA ed un continuo efflusso NAA nel ECF. Questo modello prevede un modesto deficit di aspartato nel CD causato dal mancato degrado di NAA Baslow ha descritto per NAA un ciclo “campo vicino” (near-field) ed uno “campo lontano (far-field). Il fine del ciclo campo lontano sarebbe quello di trasportare l’aspartato dalla periferia ,forse usando come veicolo, gli eritrociti (che concentrano l’aspartato). La mancanza di patologia CD in utero è attribuita all’effetto protettivo della circolazione materna, che fornisce aspartato al feto. Se l’ipoaspartia difatto costituisce un aspetto importante della patologia, questo modello prevede che un infusione di aspartato in animali o umani con carenza di ASPA potrebbe essere utile se si mantengono livelli più alti, ma non tossici entro gli CNS [13.].E’ stato suggerito da molti ricercatori che uno stato di ipoaspartia indotto dalla carenza del normale ciclo NAA potrebbe condurre ad una diminuzione nella generazione di oxaloacetato (il sostrato che limita l’indice per il ciclo dell’acido tricarbossililco) attraverso la diminuzione nelle reazioni di transaminazione, che potrebbe a sua volta disgregare il metabolismo cellulare; gruppi di ricerca stanno attualmente collaborando con Keith Hyland per quantificare (usando tecniche HPLC) i metabolici cerebroventricolari che possono sostenere o rigettare questa ipotesi.

L’idea dello squilibrio osmolare come causa sottostante dell’edema nel CD non è nuova. Alcuni ricercatori hanno osservato,in modo particolare, i trasportatori Na+/K+, data una simile patologia spongiforme che accade come risultato del trattamento in animali sperimentali con uobain, che blocca il trasportatore Na+/k+ e causa il gonfiore patologico degli astrociti e terminali assoni presinaptici [9] .Tuttavia sembra che non ci sia una patologia specifica per questi trasportatori.
Nella degenerazione spugnosa le sinapsi mostrano una normale attività ATPase ed i terminali assoni sono immutati,comunque,l’attività ATP mitocondriale è in qualche modo diminuita, forse è un marcatore di mitocondri ultratesi (overstrained), è causa possibile del tipico gonfiore astrocitico[9]. La ultrastruttura mitocondriale anormale nel morbo di Caravan tende a suggerire un modo per cause metaboliche o energetiche nella patogenesi di CD , ed è possibile che lo squilibrio dell’acqua agisca per peggiorare coesistenti problemi metabolici o energetici.

In breve,ci sono parecchie possibili teorie del normale ruolo di NAA (precursori delle biosintesi dei lipidi, TCA intermedio e osmolito), ed il suo ruolo nella patologia di CD quando manca ASPA (citotossico, metabolico e osmotico).La relativa importanza di ciascuno di questi fattori, e come essi possano funzionare insieme, deve ancora essere determinata.

Diagnosi prenatale

CD è associato ad un marcato aumento dei livelli NAA nel fluido spinale cerebrale (CFS),plasma e urina. Questo marcatore biologico divenne il metodo primario di diagnosi a seguito dell’identificazione della deficienza ASPA nei tardi anni 80[5]. Prima di allora, la biopsia chirurgica del cervello insieme alla tomografia computata
(CT) era il miglior metodo di diagnosi. Per CD sono ora disponibili consulenze e controlli prenatali, e si raccomanda ai discendenti di Ebrei Ashkenazi (che hanno una frequenza di portatori
di circa 1 su 40) ed a tutti gli altri pazienti nei gruppi ad alto rischio. Il controllo genetico basato sulla reazione a catena polimerase (PCR) è disponibile per mutazioni ben caratterizzate.

LA MALATTIA DI CANAVAN E LE TERAPIE SINTOMATICHE

La gravità dei sintomi CD varia da caso a caso in modo significativo. Il decorso clinico della malattia è progressivo in modo inesorabile, sebbene il tasso di degrado sia variabile. Attualmente non c’è trattamento di efficacia certa, sebbene la terapia genica sembri essere l’approccio più promettente, in modo particolare come migliorano la progettazione e somministrazione del vettore (fig.1). Il trattamento attuale è basato sulla combinazione di procedure di fisioterapia e strategie di supporto come modificazioni dietetiche (es.:dieta ketogenica), supplementi nutrizionali (es.:carnitina e calcio acetato) e regimi di medicine palliative come antiepilettici, ansiolitici e diuretici.

La somministrazione di calcio acetato (da 15 a 30 mg/kg. al giorno) e dell’acetazolamide (da 5 a 7 mg/kg al giorno) può essere utile nel CD. Non sono ancora stati fatti studi controllati, ma
è accertato in alcuni casi che la combinazione di queste due droghe è associata al miglioramento delle funzioni neurologiche dei bambini con CD [Kolodny E, comunicazione personale]. Il calcio acetato (Phoslo) fu somministrato originariamente a pazienti CD per controllare l’iperfosfatemia, e per caso, si scoprì che migliorava le funzioni mentali, forse a causa dell’aumentata sintesi dei lipidi; il diuretico è somministrato per diminuire ECF nel cervello. Un altro possibile approccio terapeutico potrebbe includere l’uso dell’enzima ASPA ricombinante immesso
direttamente nel cervello di bambini CD. Questo approccio non è stato sviluppato in modo sufficiente per dimostrare tutti i rischi (oltre alla chirurgia). E’ fondato sul risultato di un tentativo
fatto in Israele di somministrazione al cervello di examinadase A a bambini con la malattia di Tay Sach, è improbabile che quest’approccio possa fornire benefici a lungo termine [23 ].

MORBO DI CANAVAN E TERAPIA GENICA.

Considerate tutte insieme, le leucodistrofie sono adatte alla terapia genica sostitutiva, considerando gli effetti catastrofici della malattia, l’assenza di altri efficaci trattamenti ed il fatto che
una singola etiologia genica è stata identificata per alcuni di questi disordini CD è un bersaglio adatto in modo particolare poiché la patologia è ristretta al cervello, piuttosto che essere multisistemica, e l’effetto del transfer del gene (somministrazione ASPA) può essere eseguito in modo non invasivo usando H-NMR di livelli NAA del cervello.

Ci sono numerosi ostacoli ad un’efficace terapia genica ASPA mediata AAV ,fra i quali c’è il problema di raggiungere tutte le cellule malate e di arrivare a livelli di espressione del gene sufficientemente a lungo termine. Dal punto di vista migliore, è possibile che solo una piccola frazione di cellule transdotte possa correggere la funzione ASPA abnorme in pazienti con CD. Studi di portatori eterozigoti di alleli di mutazione ASPA hanno dimostrato che l’attività ASPA in fibroplasti possa essere solo il 40% di quella dei non portatori, tuttavia gli eterozigoti non hanno fenotipi[24.]. Quindi anche modesti miglioramenti dell’attività enzimatica possono essere sufficienti ad abbassare NAA e ad avere effetto sul corso della malattia. Inoltre c’è una variante di CD ad insorgenza tardiva (manifestazione di seri sintomi dopo l’età di cinque anni) con minore concentrazione di NAA nel cervello, per cui si ipotizza un minore difetto ASPA
dei pazienti a insorgenza precoce di CD. In due bambini con questa forma giovanile della malattia i livelli NAA di urina erano elevati, ma i livelli CNS di NAA erano inizialmente normali,
misurati con 1 H-NMR [2.].

Rappresentazione
schematica del procedimento di terapia genica.

Cervello normale:il gene ASPA (1) produce un enzima (2) che divide NAA (3) in aspartato ed acetato.

Cervello Canavan: In pazienti Canavan il gene ASPA (1) non produce l’enzima ed i livelli di NAA aumentano al di sopra della norma (2).

Terapia genica del m. di Canavan: il fine della terapia genica è somministrare un gene ASPA sintetico (1) che produce l’enzima mancante (2) che metabolizza NAA.

In questi due pazienti, l’attività di ASPA nei fibroblasti della pelle era solo da 4 a 5 % del wild-tipo, tuttavia i bambini avevano una leucodistrofia minima all’età di due quattro anni. E’ possibile che questo fenotipo più debole, nel quale la quantità di NAA nel cervello è meno pronunciata ed i sintomi sono tardivi, possa essere riprodotta somministrando ASPA nel cervello.

Nonostante gli ostacoli che il cervello offre alla terapia genica, progressi significativi sono stati fatti in due sistemi di somministrazione (liposomale e virale) per il trasferimento del gene al CNS.Il primo è un sistema di somministrazione di seconda generazione basato sul DC-CHOL/DOPE insieme alla portamina come agente condensante DNA.
Il più recente è il vettore ricombinante AAV: un parvovirus imperfetto, umano e non patogenico.E’ stato dimostrato che AAV può tradurre in modo sicuro ed efficace i neuroni ed i glia mammali, ed in un modello “rodent” del morbo di Parkinson, è stata evidenziata correzione fenotipica a lungo termine.[30..]. Inoltre, siccome AAV è estremamente piccolo (solo 20 nm), usando strategie per modificare la barriera sangue-cervello, esso può più prontamente entrare ed attraversare il parenchima cerebrale.

Durante gli ultimi cinque anni,i ricercatori hanno prodotto dati di sufficiente sicurezza in topi e primati da ottenere l’approvazione per due studi della fase clinica 1 (Università di Auckland,New Zealand e Yale University / Thomas Jefferson University,USA) riguardo alla terapia genica ASPA in bambini affetti da CD (Fig. 2);lo sviluppo di un omologo modello su topo knockout di CD è ancora in corso, e quindi non fu possibile produrre dati efficaci all’epoca in cui studi clinici furono approvati per la prima volta. Un plasmide che esprime ASPA con l’unità di trascrizione fiancheggiata da ripetizioni terminali AAV-invertito (ITRs) è stata costruita e controllata in vitro per l’espressione ASPA , e si ottennero alti livelli di attività enzimatica; questo plasmide fu poi usato in un complesso vettore non-virale per studi di espressione e tossicità animale L’espressione transgenica ASPA fu osservata al livello di mRNA che usa transcriprase riverso (RT)-PCR con primers specifici all’ASPA codificato nel vettore.
Non c’è ancora l’anticorpo monoclonale all’ASPA , e quindi non fu possibile la scoperta al livello di proteine, tranne che per i costrutti del gene di fusione.

Come metodo di somministrazione,e stato scelto [26] un nuovo DNA condensato plasmide,incapsulato nel liposoma;il plasmide espressione consisteva del primo citomegalovirus (CMV)promoter, l’aspartoacilase umano (ASPA),cDNA di lunghezza completa e di un SV40 polyA fiancheggiato da ITRs coppia base 145 AAV.Il complesso LPD fu progettato per essere somministrato nei ventricoli cerebrali, per il motivo che una larga area di superficie del tessuto cerebrale poteve essere transdotta se il vettore penetrava le cellule ependimali. I risultati negli animali dimostravano espressione nell’ependima (cellule periventricolari) con qualche limitata espressione che si estende nel parenchima.Il liposoma usato nei procedimenti di terapia genica fu in origine sintetizzato all’Università di Pittsburgh e fu lo stesso gruppo usato per altri procedimenti fase I di terapia genica[27,28]. Poly-L-lysina fu usata come polimero
cationico durante il primo procedimento di terapia genica in Nuova Zelanda su due bambini, e la protamina in 14 bambini durante il procedimento fase 1 negli USA.

Questo intervento rappresentò il primo procedimento di terapia genica umana per una malattia neurodegenerativa, ed un importante studio”prova di principio” per una malattia altrimenti fatale.I risultati iniziali appaiono promettenti,tenendo in mente che il fine degli studi fase 1 sono quelli della sicurezza e tollerabilità.A seguito della dimostrazione di sicurezza,gli sforzi sono diretti verso l’ulteriore definizione dell’efficacia di questo trattamento,usando parecchie misure di risultati clinici: l’analisi CFS,MRI (quantificazione della mielina), potenziali evocati (auditivo,visivo,somatosensoriale,e brainstem),valutazione neurologica,e rapporti dei genitori con videocassette. I dati preliminari non pubblicati che usano vettori plasmide condensati basati su AAV-ITR suggeriscono che che la terapia non virale,in vivo di CD è sicura e può essere associata con alcuni benefici biochimici, radiologici e clinici.Attualmente i nostri sforzi sono incentrati sul miglioramento e la prova di vettori virali ASPA-AAV ultra puri e high-titer da usare in futuri procedimenti clinici. La procedura di sicurezza fase 1 originaria procede in termini di raccolta di dati, ma si è fermata per quanto riguarda l’amministrazione del vettore, per sistemare verifiche e miglioramenti del vettore; si spera che nuovi vettori AAV,spinti da molti promoters specifici del cervello,permetteranno una maggiore espressione a lungo termine dell’enzima mancante.

CONCLUSIONE

CD è una malattia tragica e degna di attenzione,tuttavia l’importanza di questo studio si estende ben oltre il CD. Il progresso di un’effettiva e sicura terapia genica aiuterà nello sviluppo di trattamenti migliori per molti altri disordini neurologici, siano essi lisosomali, perossisomali, metabolici o multifattoriali. Questo secolo ha visto scoperte mediche di grande portata, che hanno scoperto le vie biochimiche e l’identità genetica sottostante molte malattie; i passi cruciali coinvolti nel progettare un’efficace terapia genica includono la determinazione della funzione dei prodotti del gene chiave associato ad una data malattia, la identificazione e caratterizzazione dei geni rilevanti, ed infine la loro manipolazione a volontà con l’aiuto di vettori
di nuova generazione. Questo è l’ultimo fine e la sfida della terapia genica: fare della biochimica l’aiuto dei nostri interventi genetici.

References of outstanding interest
of special interest

1. Pnneas JW, McDonald Wi: Demyelinating diseases. In:

Greenfield’s Neuropathology (VoI 1). Graham Di, Lantos PL

(Eds), Amold, London (i997):853.

2. Canavan MM: Schilder’s encephalitis periaxialis diffusa.

Arch Neurol Psychiatry (1931) 25:299-308.

3. Van Bogaert L, Bertrand i: Spongy degeneration of the brain
in infancy. Chaules O Thomas, Amsterdam (1967).

4. Van Bogaert L, Bertrand I: Sur une idiote familiale avec degenerescence
sponglleuse de neuraxe (note preliminaire). Acta Neurol BeIg (1949)
49:572-587.

5. Matalon R, Michals K, Sebesta D, Deanching M, Gashkoff P, Casanova
J: Aspartoacylase deficiency end Nacetylaspartic aciduria in patients
with Canavan disease. Am J Med Genet (1988) 29:463-471.

e The first study to demonstrate that ASPA deficiency is the main
biochemical de feci in CD.

6. Matalon R, Kaui R, Michais K: Canavan disease: blochemlcal and
molecular studies. Inherit Metab Dis (1993) 16(4):744-752.

7. Hoffmann GF, Gibson KM, Trefz FK, Nyhan WL, Bremer HJ, Rating
D: Neurological manifestations of organlc acid dlsorders. European
J Ped (1994)1 53:S94-i 00.

8. Traeger EC, Rapin i: The cllnical course of Canavan dlsease.
Ped Neurol (1998)18:207-212.

9. Adachi M, Schneck L, Cara J, Voik BW: Spongy degeneration of
the central nervous system (van Bogaert and Bertrand type; Canavans
disease). Hum Pathol (1973) 4:331-347.

10. Gambetti P, Meilman WJ, Gonatas NK: Familial spongy degeneratlon
of the central nervous system (Van BogaertBertrand disease). An
ultrastructural study. Acta Neuropathol (Ben) (1969) 12:103-115.

11. Adornato BT, Q’Brien JS, Lampert PW, Roe TF, Neustein
HB:

Cerebral spongy degeneration of lnfancy. A blochemical and uitrastructural
study of affected twins. Neurology

(1972) 22:202-210.

12. Sacks O, Brown WJ, Aguiiar MJ: Spongy degeneratlon of white
matter: Canavans sclerosls. Neurology (1965) 15:2165-2171.

13. Baslow MH: The existence of moiecular water pumps in the nervous
system: A review of the evidence. Neurochemistry Intemational (1
999):77-90.

Hypothesis about the formaI function of NAA as pari of an osmotic
(water) pump.

14. Mehta V, Namboodin MA: N-acetylaspartate as an acetyl source
in the nervous system. Braìn Res MoI Brain Res

(1995) 31 :151-157.

15. Kaul R, Gao GP, Baiamuwgan K, Matalon R: Cloning of the human
aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.
Nature Genet(1993) 5:118-123.

Onginal cloning ofASPA and analysis al CD mutation.

16. Baslow MH: Molecular water pumps and the aetiology of Canavan
disease: A case of the sorcerers apprentice. J InheritMetab Dis
(1999) 22:99-101.

17. Mataion R, Michals K, Kaul R: Canavan disease: from spongy
degeneration to moIecular analysis. J Ped(1995) 127:511-517.

18. Knvit W, Peters O, Shapiro EG: Bone marrow transplantation
as effective treatment of CNS disease. Curr Opin Neurol (1999) 12(2):i67-i76.

19. Pai KS, Ravindranath V: Toxicity of N

acetylaspartylglutamate and its protection by NMDA and

non-NMDA receptor antagoniste. Neurosci Lett (1991)

126:49-51.

20. Burlina AP, Skaper SD, Mazza MR, Ferrari V, Leon A, Burlina

AB: N-acetylaspartylglutamate selectlvely inhibits neuronal responses
to N-methyl-D-aspartic acid in vitro. J Neurochem (1994) 63:1174-1177.

21. Rubin Y, LaPiaca MO, Smith DH, Thibauit LE. Lenkinski RE:

The effect of N-acetylaspartate on the intraceilular free calcium
concentration in NTera2-neurons. Neurosci Lett

(1995) 198:209-212.

22. Talian HH, Moore S, Stein WH: N-Acetyl-L-aspartlc acld in brain.
J BioI Chem (1956) 219:257-264.

23. von Specht BU, Geiger B, Amon R, Passweil J, Keren G, Goldman
B, Padeh B: Enzyme replacement in Tay-Sachs disease. Neurology (1979)
29(6):848-854.

24. Barash V, Flhor D, Morag B, Boneh A, Eipeieg ON, Gilon O: A
radlometrlc assay for aspartoacylase activity In human flbroblasts:
applicatlon for the diagnosis of Canavans disease. Clinica Chimica
Acta (1991) 201(3):i75-18i.

e Aspartoacylase activity in cultured human fibroblasts (ram CD
homozygates, CD heterozygotes and control patients.

25. bit PB, Geiss-Hoitorff R, Roiiand MO, Pryds O, Muiier-Foreil

W, Christensen E, Lehnert W, Lou HO, 0ff D, Hennig J:

Magnetic resonance imaging in juvenhle Canavan dlsease.

Eur J Ped (1993)152:750-753.

e Repont on twa patients wìth a mlld juvenhle fami of CD
with elevated urine NAA cancentratian, formai NAA Ievel in the bnain
and milderphenotype.

492 Ourrent Opinion in Molecular Therapeutics 1999 Voli No 4
26. Gao X, Huang L: Potentiation of cationic Iiposomemediated gene
delivery by polycations. Biochemistry (1996)

35(3):i 027-1036.

27. Perez-Soier A, Shin DM, Siddik ZH, Murphy WK, Huber M, Lee
SJ, Khokhar AR, Hong WK: Phase I clinical arid

pharmacological study of Ilposome-entrapped NODP administered intrapleurally
in patlents with malignant pieural effusione. CIin CancerRes (1997)
3:373-379.

28. Oaplen NJ, Alton EW, Middieton PG, Donn JR, Stevenson BJ, Gao
X, Durham SR, Jeffery PK, Hodson ME, Ooutelle O:

Liposome-mediated CF~R gene transfer to the nasal epithelium of
patients with cystic fibrosis [published erratum appears in Nat
Med (1995) 1 (3):272]. Nature Med (1995) 1:39-46.

29. Taylor DL, Davies SEC, Obrenovitch TP, Doheny MH, Patsalos PN,
Oiark JB, Symon L: Investigation into the role of Nacteylespartate
in cerebral osmoregulation. J Neurochem

(1995) 65(1 ):275-281.

e Suppart far the function of NAA in osmoreguiatian, suggesting
that the vacuolar disease pathoiogy may be patentiaiiy reversed
by addressing NAA balance through (gene therapy) enzyme carrectian.

30. Kaplitt MG, Leone P, Samulski RJ, Xiao X, Pfaff DW, OMaliey
KL, During MJ: Long-term gene expression and phenotyplc correction
using adeno-assocIated virus vectors In the mammalian brain. Nature
Genetics (1994) 8:148-154.

ce This was the first paper showing expression of a transgene using
AA V in the brain and phenotypic carrection af a neuradegenerative
disease, which formed a basis far other brain interventions including
the Canavan project.